[gen] 클론 기술 : TA(TOPO) 클로닝, 재결합 기반 클로닝, 깁슨 어셈블리

Cloning 방법은 보통 같은 제한 효소로 vector, insert 각각 잘라서 붙이기만 배우지만 점점 간편하고 정확한 기술로 발전하고 있다.

플라스미드 101(제3판), Addgene Ebook

기본적인 restrictionenzyme cloning 외에 complementary overhang을 만드는 TA cloning, Recombination mechanism을 이용한 cloning, Gibson assembly를 이용한 cloing에 대해 차례로 살펴보겠습니다.

인기글

1) 타포타 클로닝

TA 클로닝(왼쪽), TOPOT A 클로닝(오른쪽). 데이비드 P. 클라크, 나넷 J. 파즈다니크, 미셸 R. McGeehee, Chapter 7 – 합성 생물학을 위한 유전자 클로닝, 편집자: 데이비드 P. 클라크, 나넷 J. 파즈다니크, 미셸 R. McGeehee, 분자생물학(제3판), 아카데믹셀, 2019년, 199-239쪽, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813288-3.00007-0 .

TA복제 TOPOTA복제 Taq DNA폴리머를 말단 전달 효소 활성으로 PCR을 삽입하고 Taq DNA중합 효소 배열, 3’말단에 단일 데옥시 아데노신(dA)삽입한다.Toverhang을는 벡터 으매 해 도고 제한 효소 둔한 가장자리 절단, ddTTP(디데옥시티미 딘 삼인산)-ddTTP, 3’히도로키실기,-dtTP, 3’히도로키실기를 가지는 것을 포함한다.TA클로닝 벡터 Ligase에 대한 링크 Taq DNA중합 효소에 의한 삽입 PCR-Topoisomerase I5′(C/T)CCTT 3’해 recognit서 cut고 3’end Toverhang에 covalently binding다한.(결합 파괴, 로에되지너 공유 결합)↓ 5’CC T/N N N 3’3’G G A/AN N 5’↑ 오ー바ー항그 삽입, 넣 공유 결합 에너지, 삽입 벡터, 이동 벡터, 토포이소메라ー제 I을 방출한다.

TOPOTATA 클로닝은 존 TA 클로닝과 게와르 ligase 다 ligation 정에 게! 2) 재결합 기반 클로닝 사이트 고유의 재결합 사이트, 재결합 사이트, 재결합 사이트, 클론을 만듭니다.Cre/loxP 시스템, FLIP/FRT 시스템, Phage at system 다 있다.- Cre/loxP

https://old.abmgood.com/marketing/knowledge_base/Cre-Lox_Recombination.php 반대 방향의 두 loxP site에 Cre recombinase가 tetramer를 이뤄within loxP site 를 cleave하고 strand exchange가 일어난다。 genemodification에서는 excision이 주로 이용된 경우 cloning에서는 원하는 gene을 원하는 vector에 넣어야 합니다.

Clontech Creator 재조합 클로닝(왼쪽), Univector 클론 시스템(오른쪽). Marsischky, G. & & LaBaer, J.（2004年）。 다수의 클론으로의 많은 경로: 고 처리량 클로닝 방법 비교 보기 게놈 연구, 14(10b), 2020-2028. doi: 10.1101/gr.2528804 loxP 사이트에 측면에 있는 플럭스드 GOI (왼쪽) 는 GOI (오른쪽) 엔트리 클론 체 \insertion \insertion\ – FLIP / FRT

(左) http://parts.igem.org/Part:BBa_K2560271 (右) Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K. & & Rubin, G. M. (2011年)。 동물 게놈을 조작하기 위한 복수의 새로운 부위 특이적 재결합. 국립과학아카데미108(34), 14198-14203. doi: 10.1073/pnas.1111704108 본은 Cre / loxP와 트랜스로케이션, GOI가 수용체 플라스미드.사도스키, 폴. (2003). Flp 더블 크로스 시스템은 DNA 단편을 클로닝하기 위한 간단한 효율적인 절차입니다. BMC 바이오 테크놀로지. 3. 9. 10.1186/1472-6750-3-9.(참고) 이러한 시스템을 이용한 cloning이 아닌 genemodification을 알고 싶다면,[basic] 유전자 변형 : (2) 조건부 녹아웃/발현 – Cre/loxP & FRT / FLP 조건부 유전자 편집 은 Cre/loxP FLP/FRT 다 보기。사이트 고유의 재조합 … 5drtr.blog.me- 게이트웨이 클론, ‘퍼지’ att 시스템타나카, Y., 키무라, T., 히키노, K., 고토, S., Nishimura , M. , Mano , S. & & Nakagaw、 T. (2012年)。 식물 유전 공학의 게이트웨이 벡터: 식물 벡터의 개요, 2분자 형광 보체(BiFC)의 응용과 다유전자 구조. 유전자 공학 – 기초, 새로운 응용과 책임. doi:10.5772/32009게이트 웨이크 론은 att system을 이용한다.원래는 Phage가 가진 attsite인 attP와 Bacteria가 갖고 있는 attB이 만난 phagegene가 bacteria gene에 integrate하는 데 이용되는 λ Phage infection system이다.attsystem이 다른 recombination system로 가장 큰 차이는 excision과 integration을 정할 수 것이다.integration을 위해서는 Integrase(Int), IHF(Integration host factor)excision을 위해서는 페이지 protein인 Xis와 Int, IHF가 필요하다.그러므로 excisionase인 Xis까지 있을 때만 excision(LR reaction)이 일어나면서 이 단백질이 없을 때는 integration(BP reaction)만 일어난다.감지된 언어가 없습니다.

입력 언어를 확인해 주세요.Integration에 필요했던 두개의 단백질, Int와 IHF를 BP clonease excision에 필요한 Int, IHF, Xis를 LR clonase라고 부른다.Gateway cloning에는 4반 att site가 사용된다.att B1&B2/att P1&P2/att L1&L2/att R1&R2기존 att system과 달리 mutated된 att1과 att2는 각각 specific에 react하기 때문에 ORF의 방향이 정해지고 있는 것이다.통상 att1이 ORF의 5’end에 att2이 3’end에 위치한다.같은 숫자는 같은 core sequence를 가지는 것을 의미하고 같은 core seq를 가진 B-P, L-R간뿐 recombine가능하다.과정을 간략히 설명하면 이렇다.BP reaction(attB+attP)에서 ORF가 들어간 Entry clone을 만들어 LR reaction(attL+attR)을 통해서 Entry clone에 있던 ORF를 Expression vector에 삽입하고 최종 Expression clone을 만든다.ATB + atP = atL + attr。ATB + atP = atL + attr。Festa, F., Steel, J.、Bian、X.、およびLabaer、J. (2013)。 기능성 프로테오믹스를 위한 고 처리량 클로닝과 표현 라이브러리 작성. 프로테오믹스, 13(9), 1381-1399.doi: 10.1002/pmic. 201200456BP reaction과 LR reaction로 expression clone이 만들어졌으면 competent E.colicell에 transform할 것이다.이때 entry clone과 exptrssion clone이 각각 다른 antibiotic resistance marker를 갖고 있으며 expression clone을 가진 cell을 select할 수 있다.또 vector의 att site사이에 flanked된 ccdB이 DNA gyrase을 inhibit하는 단백질을 coding하고 있어 ccdB sensitive E.color strain에 transform되면 그 cell growth을 저해하고 donorvector와 destinationvector, 즉 negative selection marker로 사용된다.이 cloning의 장점은 한번 entry clone을 만든 뒤 여러 종류의 vector에 제한 없이 LR reaction에서 쉽게 subcloning이 가능하다는 것과 한번에 복수의 construct을 넣을 수 있다는 것이다.3) 깁슨 어셈블리 클로닝(등온 어셈블리 반응) Gibson assembly는 세 종류의 효소를 이용한다。페스타, F., 스틸, J., 비앙, X., &라베어(2013년). 기능성 프로테오믹스를 위한 고 처리량 클로닝과 표현 라이브러리 작성. 프로테오믹스, 13(9), 1381-1399.doi: 10.1002/pmic. 201200456우선 homologous primer를 이용한 PCR로 overlapped sequence를 가진 분절을 만들었다면, 이 프레그먼트와 vector, 그리고 3개의 효소를 incubate한다.5’exonuclease:cut phosphodiester bonds from 5’endinsert와 vector의 overlapping ends에작용해 3’single stranded overhang을 만든다.이 Complementary overhang들이 annealed된다.이때 DNA가 200bp보다 짧을 경우, 전체를 버릴 수 있으니 over 200bp fragments를 사용해야 한다.polymerase:exonuclease이 overlapping sequece부분보다 더 노출시키고 annealed된 때에 생긴 gap을 채우다.ligase:이미 달린 overlapping sequece와 polymerase가 채웠다 sequece사이의 nicks를 sealing한다.이 방법은 간단하게 한 tube에서 온도 변화 없이 50℃에서 multiple fragments도 한꺼번에 담을 수 있다는 장점을 가지고 있다.Restriction enzymesite가 없거나 multiple fragments를 넣고 싶을 때 기존 제한 효소를 이용한 방법 외에도 이렇게 다른 선택지가 많다.목적과 insert, vector의 특징에 맞게 가장 효율적인 cloning 방법을 택한다면 시간과 비용도 절약하고 더 좋은 결과를 얻을 수 있을 것이다.